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細胞技術(shù)專題:腫瘤細胞的軟瓊脂集落培養(yǎng)實驗

更新時間:2014-02-20 瀏覽次數(shù):1491

標(biāo)簽: 腫瘤 軟瓊脂 集落

在體外培養(yǎng)基中由一個祖先細胞增殖形成的細胞團,稱之為集落。腫瘤細胞能無限繁殖,所以具有這種能力,而成熟分化的細胞則不能形成集落。

實驗方法

  • 基本方案
實驗方法原理HL-60細胞是一種急性早幼粒細胞白血病細胞,在體外無需加刺激因子,可在軟瓊脂培養(yǎng)基中形成集落。二甲基亞砜是一種細胞分化誘導(dǎo)劑,經(jīng)二甲基亞砜處理后的HL-60細胞按粒系途徑定向成熟分化,同時細胞的增殖力降低,幾乎全部細胞喪失了軟瓊脂中形成集落的能力。因此,這種方法可用于細胞分化的基礎(chǔ)研究和臨床腫瘤治療的療效檢驗等方面。
實驗材料

HL-60細胞

試劑、試劑盒

小牛血清 RPMI1640培養(yǎng)液 臺盼蘭 瓊脂 二甲基亞砜

儀器、耗材

超凈工作臺 二氧化碳培養(yǎng)箱 顯微鏡 培養(yǎng)瓶 吸管 酒精燈 血細胞計數(shù)板 多孔培養(yǎng)板

實驗步驟

1.  收集對數(shù)生長期的HL-60細胞,先按實驗十三測定細胞活力,然后調(diào)整細胞濃度,制成300~1 000活細胞/ml 的細胞懸液。


2.  取二個培養(yǎng)瓶每個瓶中加9 ml 調(diào)整好濃度的細胞懸液,然后各加入1 ml 3%瓊脂(已融化,在65℃水浴中放置),迅速加入,混勻。


3.  用微量加樣器吸140 μl 二甲基亞砜(MDSO),加到一個瓶中,充分混勻,為實驗組,另一瓶不加DMSO,為空白對照組。


4.  取一個16 mm 多孔培養(yǎng)板,每孔加1 ml(35 mm 培養(yǎng)皿需加2 ml)細胞瓊脂懸液,勿有氣泡,將實驗組和對照組分兩組加好,蓋上蓋并作好標(biāo)記。


5.  在室溫放置20分鐘使細胞瓊脂懸液凝固。

 

6.  然后移培養(yǎng)板或平皿于CO2培養(yǎng)箱中37℃進行培養(yǎng)。


7.  培養(yǎng)7~10天,肉眼觀察并計數(shù)細胞集落。


8.  結(jié)果:以肉眼可見的細胞團(含500個以上細胞)作為計數(shù)集落的標(biāo)準(zhǔn)。對照組HL-60細胞在含0.3%的軟瓊脂培養(yǎng)基中生長良好,每個孔中可見有多個集落形成,而實驗組HL-60細胞因經(jīng)二甲基亞砜誘導(dǎo)分化,細胞在軟瓊脂中的集落形成明顯減少。


9.  集落的計數(shù)和計算:


(1)集落數(shù)=n孔中細胞集落數(shù)總和/n孔


(2)集落形成率=集落數(shù)/接種培養(yǎng)細胞總數(shù)×100%

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