細胞技術(shù)專題：補體介導(dǎo)的細胞毒試驗
更新時間：2014-04-17 瀏覽次數(shù)：2019
1、實驗原理
帶有特異抗原的靶細胞（如正常細胞、腫瘤細胞、病毒感染細胞）與相應(yīng)抗體結(jié)合后，在補體的參與下，引起靶細胞膜損傷，導(dǎo)致細胞膜的通透性增加、細胞死亡。染料（例如：伊紅-Y、臺盼藍）可通過細胞膜進入細胞內(nèi)使細胞著色，故可用于指示死細胞或瀕死細胞，而活細胞不著色。此即補體依賴性細胞毒試驗，利用細胞毒試驗可以檢查細胞膜抗原，亦可鑒定抗體的特異性。
本實驗中，Thy-1抗原是小鼠胸腺T細胞特異的表面抗原，在體外利用抗小鼠Thy-1的單克隆抗體通過補體的協(xié)同作用，可殺傷95％以上的胸腺細胞。
2、實驗材料
（1）解剖器械(眼科剪、眼科鑷)、平皿、80～100目不銹鋼網(wǎng)；
（2）試管、lml吸量管、尖吸管；
（3）載玻片、蓋玻片；
（4）C57BL／6J小鼠；
（5）含5％NBS的冷Hank’s液；
（6）抗小鼠Thy-1的單克隆抗體（zui適稀釋度，本室制備）；
（7）補體(豚鼠新鮮血清并經(jīng)小鼠胸腺細胞吸收，預(yù)先測定效價并稀釋為*稀釋度)；
（8）1%伊紅-Y染液。
3、實驗方法
（1）小鼠胸腺細胞懸液的制備：將4～6周齡小鼠采用頸椎脫臼法處死，取出胸腺放入已加入約4ml冷Hank’s液的平皿中，在100目的不銹鋼網(wǎng)上研磨后，過篩，放入試管，離心1000rpm，5分鐘，用Hank’s液洗兩次。將沉淀的細胞重懸于Hank’s液中，配成1×107／ml細胞懸液。
（2）取試管3支，標(biāo)明順序，依據(jù)下表依次加入1×107/ml胸腺細胞懸液、抗小鼠Thy-1的單克隆抗體(zui適稀釋度)及Hank’s液，放入37℃水浴30分鐘。
| 實驗材料 | 試驗管 | 補體對照管 | 細胞對照管 |
| 1×107/ml胸腺細胞懸液 | 0.1ml | 0.1ml | 0.1ml |
| Thy-1單克隆抗體 | 0.1ml | —— | —— |
| Hank’s液 | —— | 0.1ml | 0.2ml |
| 1：3補體 | 0.1ml | 0.1ml | —— |
（3）取出后每管加入1%伊紅-Y染液1滴，混勻，室溫放置2分鐘。
（4）重新混勻后分別在一張載玻片上滴片，加蓋玻片鏡檢。先在低倍鏡下觀察，再用高倍鏡觀察，比較3管中細胞死活情況。
4、實驗結(jié)果
死細胞呈紅色，無光澤且腫脹變大；活細胞不著色、有光澤且形態(tài)正常。
高倍鏡下計數(shù)200個細胞并計算其中死細胞的百分?jǐn)?shù)。計算公式如下：死細胞百分?jǐn)?shù)= EQ EQ \F(實驗管死細胞數(shù)%-對照管死細胞數(shù)%,100%-對照管死細胞數(shù)%)
5、注意事項
（1）胸腺細胞制備速度要快，且需在冰浴中進行操作，以保持細胞活力；
（2）抗Thy-1的單克隆抗體和補體的效價要在預(yù)實驗中確定；
（3）細胞對照管死細胞數(shù)若超過5%，實驗需重新做；
（4）細胞滴加到載玻片上后長時間放置不檢測也可導(dǎo)致假陽性反應(yīng)。