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實驗原理

經過抗體測定的陽性孔，可以擴大培養(yǎng)，進行克隆，以得到單個細胞的后代分泌單克隆抗體?？寺〉臅r間一般說來越早越好。因為在這個時期各種雜交瘤細胞同時旺盛生長，互相爭奪營養(yǎng)和空間，而產生抗體的細胞有被淹沒和淘汰的可能。但克隆時間也不宜太早，太早細胞性狀不穩(wěn)定，數(shù)量少也易丟失。

克隆化的陽性雜交瘤細胞，經過一段時期培養(yǎng)之后，也還會因為細胞突變或特定染色體的丟失，使部分細胞喪失產生抗體的能力，所以需要再次或多次克隆化培養(yǎng)?？寺』螖?shù)的多少由分泌能力強弱和抗原的免疫性強弱而決定。一般說，免疫性強的抗原克隆次數(shù)可少一些，但至少要3～5次克隆才能穩(wěn)定。

實驗步驟

1. 有限稀釋法

   1) 材料

      a. 微量培養(yǎng)盤，盤內各孔于克隆化前一天培養(yǎng)小鼠腹腔細胞(即飼養(yǎng)細胞)每孔2萬～4萬。

      b. HT培養(yǎng)基

   2) 操作方法

      a. 取出抗體陽性孔細胞，用HT培養(yǎng)液制成細胞懸液。并取樣進行臺盼蘭染色，計數(shù)。

      b. 用HT培養(yǎng)液將細胞稀釋成200個/ml、40個/ml、20個/ml和的懸液。

      c. 用吸管將細胞懸液分別種入微量培養(yǎng)盤，每孔0.05ml，細胞含量分別為10個/孔、2個/孔、1個/孔和0.5個/孔。

      d. 5％CO₂飽和濕度，37℃培養(yǎng)。

      e. 每天用倒置顯微鏡觀察克隆生長情況，選擇只有一個集落生長的孔，棄掉兩個以上和沒有細胞生長的孔。

      f. 克隆大量繁殖后，布滿孔底的1/3～1/2時，測培養(yǎng)液抗體。

      g. 抗體陽性孔細胞，移到有飼養(yǎng)層的組織培養(yǎng)瓶中，并傳2～4代就可以脫離飼養(yǎng)細胞，建成克隆株。

2. 軟瓊脂克隆化

借助撒在軟瓊脂上單個細胞定位生長，而達到克隆化，具體操作如下：

   1) 配2.5％的瓊脂糖30ml，水浴溶化后，移入45℃水浴中。

   2) 將117ml*DMEM液和3ml 10倍濃度的DMEM液混合，置45℃水浴預熱。

   3) 將瓊脂糖與DMEM液混合，即為含0.5％瓊脂糖的*DMEM液，并加75×10⁸ 脾細胞。

   4) 每塊平皿加10ml，于室溫中凝固。

   5) DMEM中的細胞與DMEM—瓊脂1:1混合，將細胞瓊脂混合物2ml鋪于凝固的平板上，使其全部覆蓋。

   6) 放入CO₂箱飽和濕度，37℃培養(yǎng)10天。

   7) 用PBS配制0.6％瓊脂糖，于沸水浴溶解后，置45℃，在保溫情況下取一試管，迅速加入0.1ml 25％羊紅血球，0.2ml豚鼠補體，2.7ml 0.6％瓊脂糖。

   8) 用3ml瓊脂糖—羊紅血球混合液覆蓋克隆。于37℃CO₂箱孵育1h~2h。從克隆上部溶解羊紅血球的溶血范圍，可篩選抗羊紅血球Ig。

3. 顯微鏡操作法

在直徑6cm培養(yǎng)皿中，加入1ml 1.0×10⁸細胞懸液放置5％CO₂飽和濕度，37℃溫箱中放置30min以上，倒置顯微鏡下，尋找那些與周圍相距甚遠的單個細胞，將毛細管口(一頭有直角彎頭毛細管，一頭連接一尺長乳膠管，用口控制液體進入)水平置放于液面上，左右微動，直到看見管口，對準細胞，吸入毛細管，將管中細胞移到預先加有2.0×10⁴~5.0×10⁴飼養(yǎng)細胞96孔板內，培養(yǎng)后，即可獲得單個細胞形成的克隆。

4. 熒光激活分離法

用一種熒光激活細胞分類器(Fluorescein Activafed Cell Sorter，F(xiàn)ACS)。其基本原理是：將細胞經熒光抗體染色后，經噴嘴形成單個細胞的線形液滴，在萊塞光激發(fā)下，熒光素發(fā)射熒光，此信號由光電倍增管接收，再結合細胞形態(tài)大小產生光散射信號，經電腦處理，產生信號并與預定的信號對比，根據(jù)細胞熒光強度及細胞大小不同，將細胞分成不同級別，在電場中發(fā)生偏離，而分別收集于不同容器中。