DNA實驗技術(shù)：化學法測定DNA的含量——二苯胺顯色法
更新時間：2013-08-22 瀏覽次數(shù)：2106
（一）原理
DNA 在酸性條件下加熱，其嘌呤堿與脫氧核糖間的糖苷鍵斷裂，生成嘌呤堿、脫氧核糖和脫氧嘧啶核苷酸，而2-脫氧核糖在酸性環(huán)境中加熱脫水生成ω-羥基-γ-酮基戊糖，與二苯胺試劑反應生成藍色物質(zhì)，在595nm 波長處有zui大吸收。DNA 在40-400μg 范圍內(nèi)，光吸收與DNA的濃度成正比。在反應液中加入少量乙醛，可以提高反應靈敏度。
（二）試劑及器材
1. DNA標準溶液
準確稱取小牛胸腺的DNA 鈉鹽，以0.01mol/L NaOH 溶液配成200μg/mL 的溶液。
2. 測定樣品溶液
準確稱取干燥的DNA 制品，以0.01mol/L NaOH 溶液配成100-150μg/mL 的溶液。若要測定RNA 制品中的DNA 含量，樣品中至少要含有DNA 20μg/mL 才能進行測定。
3. 二苯胺試劑
稱取1g 二苯胺， 溶于100mL 的分析純的冰乙酸中，再加入60%以上的過氯酸10mL,混勻待用。臨用前加入1mL 的1.6%乙醛，配好的試劑應為無色。
4.分光光度計
（三）操作方法
1. 制作DNA 標準曲線：取12 支潔凈干燥試管按表1 加入試劑：
表1 DNA標準曲線制作
按上表加完各試劑后，充分混勻。于60℃水浴中保溫1h,冷卻后于595nm 波長處以1,2 管為空白調(diào)零，測定各管光密度（OD595nm）。取兩管的平均值，以DNA 的含量為橫坐標，光密度為縱坐標，繪制標準曲線。
2. 樣品DNA 含量測定：取2 支干凈試管按表2 加入試劑，其它操作同上。
表2 樣品DNA 含量測定
待測溶液中的DNA 含量應調(diào)整至標準曲線的可讀范圍內(nèi)。
3. DNA 含量計算：以樣品的光密度，從標準曲線上查出相對應DNA 含量，按下式計算出樣品中DNA 的百分含量。
附 注：二苯胺試劑具有腐蝕性，且二苯胺反應產(chǎn)生的藍色不易褪色，操作中應防止灑出，比色時，比色杯外面一定要擦干凈。